該研究有*意義，是有史以來篇用步態分析系統（CatWalk）來評價骨重建中疼痛緩解，并用局部麻醉鎮痛的文章。文章來源于The Journal of Pain（2017年影響因子4.859），2018年5月15日發表，本文將為大家做詳細闡述。

有文獻報道這種疼痛是自體骨移植術后的主要并發癥之一 , 可能危及手術全程的成功，這種疼痛必須在術后3-4天內得到控制和減少，以防止它變成慢性的。術后前四周的疼痛護理會更地降低其轉化成慢性疼痛的風險。

傳統治療會給予系統的鎮痛劑，比如對乙酰氨基酚，非甾體抗炎藥和含嗎啡的藥品，這些傳統的對身體的損副作用和傷害大，同時鎮痛劑處方會增加總體花費。磷酸鈣（CaP）骨替代物和CaP骨水泥（CPC）現在被認為是許多骨填充骨科手術適應癥的標準治療方法。

它們可以被細胞吸收，具有明顯的骨傳導特性，作為局部藥物傳遞系統，可以與生物活性分子和治療劑結合。由于CPCs已成為許多骨科及外傷適應癥的治療方法，因此作者設計了一種新型的生物注射材料，將CPC與不同的局部麻醉藥粘合在一起，用于骨科或骨外傷適應癥。

作者目的是1）通過步態分析系統（CatWalk）對骨填充手術術后疼痛進行功能評價；2）評價骨損傷填充手術結合使用的磷酸鈣水泥對于術后疼痛的緩解；3）評估他們的機械和生物學性能。具體方法是利用手術在大鼠股骨遠端制造了一個臨界大小的骨缺損模型，并在其損傷處以裝載或不裝載帶局部麻醉劑的注射用磷酸鈣骨水泥（CPC）為填充來緩解骨重建修復術后的疼痛。

通過使用步態分析系統（CatWalk）所測量的步態的變化來對比不同的CPC裝載材料對于CPC骨重建修復手術后創傷疼痛的緩解。結果表明，術后短期時間內，在腳印面積和腳印平均接觸強度這兩個指標上兩種鎮痛方法都有顯著的疼痛緩解。與術前的基礎值相比，CPC組，裝載羅哌卡因CPC組(CPC-Ropi)，和裝載丁哌卡因CPC組 (CPC-Bupi)在第24小時，腳印面積值分別降低了65%, 42%和24%，同時腳印平均接觸強度也分別降低了25%, 9%和1%。CPC-Bupi比CPC-Ropi有更的功能康復效果。

除此之外，CPC手術保持了機械和生物學性能。這步態結果可能乍一看有點不思其解，這三個組都比對照組降低了啊，怎么說明哪個比哪個好呢？ 這個結果側面說明了疼痛程度，對照組的肯定高，這三個手術組的老鼠疼啊，所以腳爪接觸面積和接觸強度肯定是都降低的，哪個方法效果更佳，肯定是降低的數值更少的那個了。

在過去的十年里，步態分析系統（CatWalk）已經被證明是一種無創的評估慢性疼痛的方法，被證實為研究嚙齒類動物許多疾病模型的方法工具，如神經退行性疾病，肌筋膜炎癥，周圍神經損傷，骨關節炎，外傷。該方法通過視頻跟蹤分析步態，對每個爪印的時空參數和動態肢體協調進行了完整的分析。

上圖所示，大鼠術后步態分析采用步態分析系統（CatWalk）具體參考之前文獻報道，總的來說CatWalk的原理是：大鼠在一條8厘米寬的走廊里，非強迫自主穿過一塊發光的玻璃板，與玻璃板接觸后，腳爪把綠燈反射到下面的攝像機（100HZ）上，攝像機就會記錄整個運動的過程。每只動物的每一次實驗的步態相關指標都會被系統記錄，整個過程沒有食物誘導刺激。

手術過程見下圖：

圖1，骨水泥手術過程

A）手術一個圓柱狀尺寸合適的切口；（B）填充注射骨水泥修復；（C）在縫合之前填充切口

實驗分組：3個CPC實驗組，其實還有1個隱藏組（Control）：手術前后的自身對比

1. Control group (preoperation的Control組)

2. CPC unloaded with anesthetic agent (CPC組)

3. CPC loaded with 8% bupivacaine (CPC-Bupi組)

4. CPC loaded with 8% ropivacaine (CPC-Ropi組)

實驗protocol：手術前兩周，每天讓大鼠適應走廊環境在其中自由活動，手術前一天的適應訓練的數據作為術前參考值。為了排除個體差異性，用每一只自身手術前后的值來對比統計。分別在手術后第2,4,6,24,48,72小時,以及第7天第14天測CatWalk數據。步態分析實驗對清楚磷酸鈣水泥的相同實驗員設盲，開始操作注射水泥的時間記為第0天。

下來是實驗裝置和具體統計的數據：步態分析系統的走廊長42cm，符合標準的步態會被記錄：1）通過走廊全程的時間在1-5秒之間；2）速度大變化不超過80%，標準之外的數據系統不會去采集記錄（圖2A）。統計以下數據：

 1、腳印面積 (cm2) 是在站立時相完整腳印的表面積（圖2B）。

2、腳印平均接觸強度（AU）：完整腳印在一個步長周期中步態支撐期接觸的平均強度（圖2C）。  

3、腳印長度（cm）：第三指中間到腳后跟的距離（圖2C）。

4、支撐期比重（%）：在一個步長周期中，支撐期所占比重（圖2D）。

這四個指標都是經典的用來衡量疼痛與康復的數據，其中腳印平均接觸強度被報過用來評估神經性疼痛，包括機械性痛覺超敏。

圖2， 健康大鼠的步態分析效果圖

（A）對照組大鼠在CatWalk系統上的背景圖；（B）術前的CatWalk腳?。_印面積）左腳印紅色，右腳印藍色，后肢顯示淺色，前肢深色；（C）一個正常大鼠的右后腿爪，顯示出的手動腳印測量長度和腳印接觸強度；（D）術前CatWalk步態圖

除了做步態分析外，作者還做了掃描電鏡和組織學實驗，更進一步驗證自己的實驗。在Leo 1450VP掃描電鏡圖像下，手動標記興趣區（活性區域）包括新形成的骨和水泥吸收的表面部分，這個在后面具體的電鏡數據上來直觀地觀察這三個部分的變化。

圖3，股骨植入后的掃描電鏡圖像

使用Leica QWin Pro軟件來分析興趣區，具體是：（A）生物活性區（淺藍色區域），它包括了（B）新形成的骨頭（綠色區域）和（C）骨水泥吸收的表面（藍色區域）。

接下來就是數據結果分析了，首先是CatWalk的結果分析：手術前，動物步態正常，與對側相比，右后腿爪的印紋面積和印紋長度沒有顯著差異。術前基礎參考的平均值為：腳印面面積1.88±0.03 cm2，腳印平均接觸強度115.28±0.55 AU，腳印長度1.86±0.02cm2，支撐期比重66.34%±0.56%。

 圖和6A顯示的是手術前后腳印面積的變化。CPC組腳印面積從2.04±0.07 cm2手術前的值下降到24小時之后的0.66±0.06 cm2，14天以后逐漸增加到1.60±0.06 cm2。在這兩種骨水泥中，在術后次減少后，與未加載的CPC在14天時相比，兩種均可以更快地恢復到基線值。

術后24小時，骨水泥處理大鼠的步態變化達到高水平（從基礎值降到低），這說明了CPC-Bupi和CPC-Ropi組的相比CPC組腳印面積有了顯著增加（P＜0.01）：CPC-Bupi組1.44±0.06 cm2，CPC-Ropi組1.10±0.06 cm2，圖5B中腳印圖也可以很直觀的對應此結果。與此同時，兩種水泥之間也是有差異的，CPC-Bupi組腳印面積明顯大。術后48小時后，兩種水泥跟CPC相比，依然有差異，一直持續到第7天，CPC-Bupi組恢復到手術前的基礎值時才消失。

圖5，實驗組術后右后爪的腳印面積

(A) CPC組表示為黃色實線，CPC-Bupi組藍色點虛線，PC-Ropi組綠色點劃線，手術前的參考組黑色虛線。用雙因素方差分析，事后分析Fisher檢驗，結果表示為平均值±標準差(N = 6),* P < 0.01 (CPC-Bupi vs CPC-Ropi vs CPC),** P < 0.01 anesthetic loaded-CPCs vs CPC, # P < 0.01 CPC-Bupi vs others；（B）手術后24小時每組腳印面積圖

接觸強度的結果也是這樣（圖6B）。術后24小時，與術前基礎值相比，CPC組，CPC-Bupi和CPC-Ropi組分別下降了25%±2%，9%±2%，1%±2%。這三組互相比較都有顯著差異（P＜0.01），48小時后，CPC組下降至低（79%±2%），分別與CPC-Ropi組（96%±2%）和CPC-Bupi組（98%±2%）比較。有趣的是，CPC-Ropi組全程跟術前的基礎值相比都沒有統計差異，這一點很費解。術后第14天，CPC組和CPC-Bupi組開始回到基礎值，這種差異才消失。

與腳印面積結果一致，腳印長度在術后是降低的（圖6C）。24小時后，CPC組腳印長度的值為72%±2%，CPC-Bupi組和CPC-Ropi組分別為91±2%，88±2%，與CPC組相比這兩組都有統計差異（P＜0.01），但是CPC-Bupi組和CPC-Ropi組本身沒差異。7天后，這兩組與術前基礎值相比也沒差異了。

圖6，三種骨水泥的4種測試參數

（A）術前腳印面積的基礎值；（B）術前腳印接觸強度的基礎值；（C）腳印長度占術前的百分比重；（D）支撐期比重占術前的基礎值百分比；CPC組表示為黃色實線，CPC-Bupi組藍色點虛線，PC-Ropi組綠色點劃線，手術前的參考組黑色虛線。用雙因素方差分析，事后分析Fisher檢驗，結果表示為平均值±標準差(N = 6), * P < 0.01 (CPC-Bupi vs CPC-Ropi vs CPC), ** P < 0.01 loaded-CPCs vs CPC, # P < 0.01 CPC-Bupi vs others

支撐期比重在整個手術過程中都沒有表現出來差異，這兩種水泥組也沒有差異。相反，在24小時后，CPC組支撐起比重值降低并且和兩種水泥組相比有顯著差異（P＜0.01）：CPC組84%±2%，CPC-Ropi組95%±2%和CPC-Bupi組99%±2%。術后48小時開始差異消失，第7天恢復至術前的值。

結果除了步態分析，還有SEM（掃描電鏡）和組織學結果分析，可見作者實驗設計的嚴格和縝密，手術3周后，注射植入的骨水泥仍然在注射的位置可見，同時新生的骨質層相同位置也能觀察到骨水泥 (圖7A)。

不僅如此，所有骨水泥均觀察到骨樣組織與成骨細胞細胞系交界，這說明使用三種不同的骨水泥，不影響新生骨質的生長。在所有的骨水泥（與骨組織之間），可以看到骨組織被一條由成骨細胞排成的線標記出邊沿，這說明不同骨水泥中的藥物的釋放，并沒有改變骨質-骨水泥界面和骨修復。

上圖7為 （A）手術后的掃描電鏡圖像；（B）結果表示為新骨形成相比于興趣區的百分率

圖8術后3周后股骨標本的組織學分析。（A）Movat染色法觀察全水泥置入后的效果（藍色=水泥；黃色-綠色=骨，淡粉色=軟組織）；（B）Movat染色下的新骨形成的詳細圖像（紅線=骨樣組織，紫線=成骨細胞細胞株）；（C）蘇木素-伊紅染色觀察骨髓

步態和掃描電鏡做完了，作者還不放心，又做了組織學的實驗，組織學分析沒有發現任何不良炎癥反應，(圖8)。圖8A 顯示的是在植入骨水泥手術后整個Movat’s染色的圖（藍色=水泥；黃色-綠色=骨，淡粉色=軟組織） Movat染色法能在一張組織切片上確定多種結締組織成分，能有效的區分軟骨的鈣化，能明顯的區分成骨細胞破骨細胞和其他成分，在研究骨的生長和修復中起關鍵作用。還有更細節的地方，染色圖里的新骨形成圖8B（紅線=骨樣組織，紫線=成骨細胞細胞株），與未加載的CPC相比，藥物的局部釋放并沒有改變加載CPCs的骨水泥界面和骨結合，后再來個蘇木素-伊紅染色看看骨髓的情況。

作者很嚴謹，后提出了出于動物倫理原因，手術過程中作為麻醉動物用的鹽酸丁丙諾非是按先發鎮痛作用皮下注射的，半衰期比嗎啡還長（大于6小時），所以擔心這種長效麻醉作用影響CatWalk早期階段的數據，同時手術情況和CatWalk實行雙盲，也是嚴謹的另一面。到這里就算做完了，得出結論：本文的意義在于開創了一個用來評價骨重建修復引起的疼痛的指導方法：CatWalk步態分析體統從行為上直觀直接的測試，并且用了這種CPC材料和局部麻醉劑的結合來研究骨手術術后重建疼痛的緩解，對該領域的研究起到指導和借鑒作用。

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